細胞生物學(xué)：星型膠質(zhì)細胞的純化培養(yǎng)方法
來源：網(wǎng)絡(luò)發(fā)布時間：2009-09-22
提供一種星型膠質(zhì)細胞的純化培養(yǎng)方法：
1. 分離大鼠胚胎（16-18周）新皮層，置于L-15（或Hank‘s平衡鹽/DMEM溶液，無Hepes）培養(yǎng)基中，除去腦膜和血管、海馬、尾核和其他非皮層組織。
2. 用解剖刀將其切成1mm3大小的組織塊。
3. 用1ml槍頭轉(zhuǎn)移250μl膠原酶儲存液（1.33%，溶于L-15中）到1ml的L-15（或D-MEM）中。每2只鼠腦組織塊使用1-1.5ml稀釋膠原酶液。
4. 37℃水浴中孵育30min.
5. 1000rpm（大約230g）中離心5min，或3000rpm（大約2000g）中離心1min.
6. 去上清。
7. 在含EDTA-CMF的溶液中重懸細胞，并與胰蛋白酶以1：4～1：10比例混合�？梢愿鶕�(jù)觀察到的細胞消化的情況，適當(dāng)調(diào)整兩者的比例。
8. 加入胰蛋白酶的抑制劑和DNase溶液，混合5分鐘。
9. 1000rpm（大約230g）中離心5min，或3000rpm（大約2000g）中離心1min.
10.去上清。加入500μl D-MEM-BS.
11.輕輕吹打成單細胞懸液，開始用5ml槍頭吹打10次，在需要時用18-gauge的針頭吹打。（ 注意：不要產(chǎn)生氣泡。）200目/300目尼龍網(wǎng)過濾。
12.將細胞轉(zhuǎn)移到含10%FCS-DMEM的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)密度為2X106/25cm2培養(yǎng)瓶，4～6 X106/75cm3培養(yǎng)瓶。在37.2℃，37.5%中培養(yǎng)。
13.第2天換液，以后每隔3天換液。
14.7-10天，細胞發(fā)生融合。
15.細胞融合后，將瓶蓋用封口膜密封好，在軌跡搖床上培養(yǎng)，旋轉(zhuǎn)速度以不產(chǎn)生氣泡為宜。37℃振搖過夜。細胞注意避光。
16.去上清，加入新鮮10%FCS-DMEM.
17.加入200μl 1mM的阿糖胞苷/10ml培養(yǎng)基。在37.2℃，37.5%中培養(yǎng)孵育48小時以消除分裂的細胞。
18.換用新鮮10%FCS-DMEM，孵育恢復(fù)24小時。
19.重復(fù)17-18步驟，消除所有的分裂細胞。
